描述：豬圓環(huán)病毒II型、III型PCR試劑盒是上海臻科生物科技有限公司的產(chǎn)品,靈敏度好,準確性高,現貨供應,歡迎廣大新老客戶(hù)前來(lái)選購。
【產(chǎn)品名稱(chēng)】豬圓環(huán)病毒II型、III型PCR試劑盒
【包裝規格】 50T/盒
【產(chǎn)品方法】雙色實(shí)時(shí)熒光PCR法
【預期用途】
本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，定性檢測豬圓環(huán)病毒II型、III型，對豬圓環(huán)病毒II型、III型引起的***的診斷和監控具有重要指導意義。
豬圓環(huán)病毒II型、III型PCR試劑盒【檢驗原理】
本試劑盒針對豬圓環(huán)病毒II型、III型高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含豬圓環(huán)病毒II型、III型基因組模板的情況下，PCR反應得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過(guò)程中相應通道的信號強度進(jìn)行實(shí)時(shí)監測和輸出，實(shí)現檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
RT-PCR反應液 | 50T/盒 |
逆轉錄酶 | 750 μL×1管 |
Taq酶 | 100 μL×1管 |
陽(yáng)性對照 | 150 μL×1管 |
陰性對照 | 40 μL×1管 |
說(shuō)明書(shū) | 1份 |
【儲存條件及有效期】
避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期為12個(gè)月。
【檢驗方法】
1.試劑準備（試劑準備區）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著(zhù)液體。
（2）核算當次實(shí)驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實(shí)驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽(yáng)性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
單反液配制表(每份) | RT-PCR反應液 | 15.0 μL |
逆轉錄酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
（3）在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
（4）蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管轉移至樣本處理區。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準備（樣本處理區）
用QIAGEN、Roche公司DNA提qu試劑盒提quDNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉移到PCR儀器上。
根據需要，在上述準備好的PCR反應管中分別加入陰性對照品以及陽(yáng)性對照品各5 μl，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴增區）
（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數進(jìn)行PCR擴增。
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時(shí)不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 AIV-H5熒光信號 HEX通道采集 AIV-N6熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數 |
反轉錄 | 42℃：10分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結束時(shí)采集熒光信號） |
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽(yáng)性對照：有典型S型擴增曲線(xiàn)或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線(xiàn)形為直線(xiàn)或輕微斜線(xiàn)，無(wú)指數增長(cháng)期。
2.標本結果判定：
（1）陽(yáng)性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長(cháng)期。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時(shí)應對標本進(jìn)行重復檢測，如重復實(shí)驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長(cháng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無(wú)Ct值。
【檢驗方法的局限性】
當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會(huì )發(fā)生假陰性的結果。
本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽(yáng)性結果應進(jìn)一步使用培養法進(jìn)行確診。
【注意事項】
使用本試劑盒的實(shí)驗室，應嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實(shí)驗室管理規范進(jìn)行管理；
為避免RNA降解，樣本處理過(guò)程應在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗后立即上機檢測；樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理；
各區域物品均為專(zhuān)用，不得交叉使用，以免污染；檢測結束后，應立即對工作臺清潔；
吸取反應液時(shí)，應盡量避免產(chǎn)生氣泡；上PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結果不準確；
試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時(shí)離心；
試劑盒內所配陰性和陽(yáng)性對照在第一次使用前應全部轉移至標本準備區，并單獨存放；
為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進(jìn)行任何標記；
檢測過(guò)程中使用過(guò)的吸頭，應直接打到盛有10%次氯酸的廢物缸內，檢測結束的PCR 反應管，切忌開(kāi)蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實(shí)驗用品應定期用10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒；
9.儀器擴增相關(guān)參數應按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內使用。
