在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

PCR（PCR擴增區(qū)）

反應體積	25 μL	通道選擇	FAM通道采集LSDV熒光信號
PCR 反應條件	步驟	條件	循環(huán)數(shù)
	UNG處理	37℃：2分鐘（min）	1
	預變性	95℃：3分鐘（min）	1
	PCR擴增	95℃：5秒（s）	40
	PCR擴增	58℃：40秒（s）（此階段結(jié)束時采集熒光信號）	40

（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。

（2）按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。

2.標本結(jié)果判定：

（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。

（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗方法的局限性】

當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

本試劑盒僅供標本初步篩查使用，對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應進一步使用培養(yǎng)法進行確診。

【注意事項】

使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；

為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理；

各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結(jié)束后，應立即對工作臺清潔；

吸取反應液時，應盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確；

試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心；

試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū)，并單獨存放；

為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進行任何標記；

檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同后丟棄；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；

9.儀器擴增相關(guān)參數(shù)應按照本說明書相關(guān)要求進行設置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用。

【相關(guān)產(chǎn)品】

ZK-D-0240馬流感病毒（EIV）核酸檢測試劑盒（熒光-PCR法）
ZK-D-0241貓杯狀病毒（FCV）核酸檢測試劑盒（熒光-PCR法）
ZK-D-0242麻疹病毒（MV）核酸檢測試劑盒（熒光-PCR法）
ZK-D-0243貓傳染性腹膜炎（FIP)核酸檢測試劑盒（熒光-PCR法）

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巴貝斯蟲PCR試劑盒

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