牛雌激素（E）ELISA試劑盒廠(chǎng)家
l本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中牛雌激素（E）的含量。
有效期：6個(gè)月
保存條件：2-8℃
本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷
實(shí)驗原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被牛雌激素（E）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過(guò)溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的牛雌激素（E）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長(cháng)下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
樣本處理及要求
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會(huì )影響測量結果），稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復凍融。后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4. 細胞培養物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會(huì )影響后檢測結果，因此溶血標本不宜進(jìn)行此項檢測。
需要而未提供的試劑和器材
1.酶標儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
名稱(chēng) 96孔配置 48孔配置 備注
微孔酶標板 12孔×8條 12孔×4條 無(wú)
標準品 0.3mL*6管 0.3mL*6管 無(wú)
樣本稀釋液 6mL 3mL 無(wú)
檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無(wú)
20×洗滌緩沖液 25mL 15mL 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋
底物A 6mL 3mL 無(wú)
底物B 6mL 3mL 無(wú)
終止液 6mL 3mL 無(wú)
封板膜 2張 2張 無(wú)
說(shuō)明書(shū) 1份 1份 無(wú)
自封袋 1個(gè) 1個(gè) 無(wú)
備注：
1. 標準品濃度依次為：160、80、40、20、10、5 pg/mL
2. 經(jīng)過(guò)大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實(shí)驗過(guò)程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過(guò)大標準品濃度時(shí)，可用樣本稀釋液將標本進(jìn)行適當稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗。
注意事項
1.嚴格按照規定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2.洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過(guò)程中不要讓微孔干燥掉。
3.消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
4.底物顯色液應呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
5.避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。
6.在儲存和溫育時(shí)避免強光直接照射。
7.平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8.任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會(huì )破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。
9.不能使用過(guò)期產(chǎn)品。
10.如果可能傳播疾病，所有的樣品都應管理好，按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。
試劑準備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋?zhuān)赫麴s水按1：20稀釋?zhuān)?份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3. 樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長(cháng)處測定各孔的OD值。
實(shí)驗結果計算
以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關(guān)軟件繪制標準曲線(xiàn)，并得到直線(xiàn)回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。
試劑盒性能
1. 檢測范圍：5 pg/mL – 160 pg/mL。
2. 靈敏度：低檢測濃度小于1.0 pg/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結構類(lèi)似物交叉反應。
4. 重復性：板內變異系數小于10% ，板間變異系數小于15% 。
