孔雀石綠ELISA試劑盒操作說(shuō)明
（酶聯(lián)免疫法）
1 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測測樣本中的孔雀石綠。（ MalachiteGreen oxalate ，MG)，試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時(shí)，加入標準品或樣品溶液，樣本中的孔雀石綠和酶標板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗孔雀石綠抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含孔雀石綠含量成負相關(guān)，與標準曲線(xiàn)比較即可得出樣本中孔雀石綠的殘留量。
2 技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.025ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：25℃， 30min～30min～15min
2.3 檢測下限：
魚(yú)/蝦…………………………0.1ppb
2.4 交叉反應率：
結構類(lèi)似物 | 交叉反應率 |
孔雀石綠 | 100% |
結晶紫 | 80% |
隱性孔雀石綠（經(jīng)氧化后） | 100% |
隱性結晶紫（經(jīng)氧化后） | 80% |
2.5 樣本回收率：
魚(yú)/蝦等水產(chǎn)品、水樣……………85%±15%
3 試劑盒組成
酶標板………………………………96孔
高濃度標準品溶液1瓶（1ml/瓶）：10ppb（高標準液有揮發(fā)性，需注意密封）
標準品溶液0ppb、0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.2ppb、0.4ppb（均為空瓶子，現配現用）。
酶標記物（紅蓋）…………………11ml
抗體工作液（藍蓋）………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
助溶劑（黃蓋）………………………6ml
氧化劑（黑蓋）………………………6ml
10X復溶液（黃蓋）…………………20ml
20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
說(shuō)明書(shū)………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱
4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl、100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙腈（色譜純）、乙酸乙酯、甲醇
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實(shí)驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗結果。
5.2 配液：
配液1：1×樣品復溶液
以100 ml為例，取10 ml 10×復溶液加入50ml去離子水和40ml甲醇，充分混勻。
配液2：1×工作洗滌液
將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 魚(yú)、蝦
1）取勻質(zhì)無(wú)骨的樣品1 g，加入50 ml離心管中，加入0.3 ml 乙腈、6 ml乙酸乙酯，充分震蕩（不少于5分鐘，確保魚(yú)肉沒(méi)有結塊）；
2）室溫下4000r/min 離心10min，取上清液3 ml加入10ml玻璃試管中，再加入氧化劑50 ul，震蕩2分鐘；
3）每管加入助溶劑50 ul(不振蕩)，50℃水浴環(huán)境下氮氣吹干（吹完之后管底部應該有一滴液狀物，當樣本含油脂過(guò)高時(shí)，此時(shí)可見(jiàn)試管底部殘留有黃色粘稠狀液滴）；
4）加入1 ml 1×樣品復溶液，溶解混勻，取50ul用于分析。
樣本稀釋倍數：2 檢測下限：0.1ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì )有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實(shí)驗開(kāi)始前需配制標準品應用液；低濃度的標準品不穩定，需現配現用（配好的標品在4℃可穩定1個(gè)月）。
在0ppb的瓶中加1×樣品復溶液3ml，0.025ppb、0.05ppb、0.1ppb、0.2ppb的瓶中分別加1×樣品復溶液1.5ml，0.4ppb的瓶中加1×樣品復溶液2.88ml。
標準液6：取10ppb高濃度標準品溶液120ul加入裝有2.88ml 1×樣品復溶液的0.4ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.4ppb。
標準液5：取1.5ml標準液6加入裝有1.5ml 1×樣品復溶液的0.2ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.2ppb。
標準液4：取1.5ml標準液5加入裝有1.5ml 1×樣品復溶液0.1ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.1ppb。
標準液3：取1.5ml標準液4加入裝有1.5ml 1×樣品復溶液的0.05ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.05ppb。
標準液2：取1.5ml標準液3加入裝有1.5ml 1×樣品復溶液的0.025ppb的瓶中，蓋緊，混勻，濃度即為0.025ppb。
標準液1：直接使用1×樣品復溶液，濃度即為0ppb。
6.1 編 號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個(gè)樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應30分鐘。
6.3 洗 滌：將孔內液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，后用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 加酶反應：加酶標記物100µl/孔，25℃避光反應30分鐘。
6.5 洗 滌：同上
6.6 顯 色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過(guò)淺，可適當延長(cháng)反應時(shí)間）。
6.7 終 止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.8 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長(cháng)450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。
7 結果分析
7.1 百分吸光率的計算
標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以di一個(gè)標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝ | A | ×100% |
A0 |
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線(xiàn)的繪制與計算
以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數為橫坐標，繪制標準液的半對數曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線(xiàn)中，從標準曲線(xiàn)上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中待測物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。
8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（25℃）會(huì )導致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過(guò)程中如果出現板孔干燥的情況，則會(huì )出現標準曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進(jìn)行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過(guò)程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線(xiàn)照射。
8.5 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。
